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α-1,3-巖藻糖基轉移酶分子定向進化研究
瀏覽: 發布日期:2019-10-18

Sci. Adv.:基于單細胞超高通量篩選方法的α-1,3-巖藻糖基轉移酶分子定向進化

巖藻糖基化是生物體內一類常見的糖基化修飾,在血型決定、免疫調控、神經發育以及腫瘤發生等生理過程中均發揮著重要作用。含巖藻糖的糖鏈結構不僅可以作為腫瘤診斷的關鍵分子標記,也有潛力作為抗腫瘤糖疫苗藥物,或作為益生元廣泛地應用于嬰兒配方奶粉、功能性食品、食品添加劑以及保健藥品等領域。自然界的巖藻糖基化反應由巖藻糖基轉移酶(Fucosyltransferases, FucTs)催化,但這類酶的催化活性通常較低,極大的限制了巖藻糖類的大規模應用。定向進化技術通過在實驗室中模擬自然進化的過程,可以有效改善酶的性能。由于其在酶工程領域的重要作用,定向進化技術于2018年獲得了諾貝爾化學獎。然而,由于巖藻糖基轉移酶的反應難以用常規實驗方法進行高通量篩選,對這類酶的定向進化改造一直沒有取得突破。

 

上海交通大學楊廣宇()研究團隊在Science Advances在線發表論文,報道了在巖藻糖基轉移酶定向進化方面的最新研究進展。博士生譚玉萌張勇助理研究員為本文共同第一作者。

 

在該研究中,研究團隊巧妙的利用了細胞膜表面的半乳糖透酶(LacY基因)對底物及糖基化產物通透性的差異,建立了可以利用流式細胞儀在單細胞層面對FucTs進行活性檢測的FACS篩選體系,速度達到每小時107個克隆以上,一舉打破了這類酶的篩選瓶頸。研究團隊證明了這一系統可作為一種通用的篩選工具,用于α-1,3-巖藻糖基轉移酶、α-1,2-巖藻糖基轉移酶,以及巖藻糖苷酶的轉糖苷活性等糖基化反應的定向進化中。

 

為驗證這一體系的有效性,他們對來源于幽門螺桿菌的α-1,3-巖藻糖基轉移酶(FutA)進行了定向進化,成功獲得了目前國際報道催化效率最高的突變體,為巖藻糖苷類產品的生物合成提供了高效的催化劑。重要的是,他們通過解析突變酶M32的晶體結構,揭示了突變體功能改變的催化機制,發現突變體α2 Helix的S45突變成F45后,與周圍的芳香族氨基酸殘基W33和W34形成了獨特的“夾鉗”結構,將受體底物牢牢的固定在底物結合口袋內,從而使得酶與底物的親和力提高;并通過分子動力學模擬發現了α5 Helix鉸鏈區D127N,R128E及H131I的三個氨基酸殘基的電荷突變促進域間的相對運動變化,提出了動態鉸鏈彎曲運動引發域間運動模型,為揭示GT-B型糖基轉移酶的調控機制及進一步的分子改造提供了線索。

 

該研究建立了首個針對巖藻糖基化酶的單細胞超高通量篩選技術平臺,并解析了GT-B型糖基轉移酶催化調控的機制,為其它糖基轉移酶的分子改造提供了重要的工具和指導,有望促進糖生物技術領域的進步和重要寡糖產品的生物催化產業發展。

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